15.28. XÁC
ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL
TRONG VẮC XIN VÀ SINH PHẨM
Phương
pháp 1:
Nguyên lý
Phương pháp
dựa vào phản ứng tạo màu của thuốc thử
Folin với phenol
Phương pháp tiến hành
Vắc xin
mẫu thử được ly tâm với vận tốc
3000 vòng/phút trong 15 phút. Bỏ cặn, lấy 1 ml nước cất ở
phía trên cho vào bình định mức 100 ml và cho nước cất vừa đủ 100 ml, lắc
đều.
Lấy 0,5
ml dung dịch trên, thêm 9 ml nước
cất, 0,5 ml thuốc
thử Folin (TT) pha
loãng 2 lần, 2 ml dung dịch
natri carbonat 20% (TT). Lắc
đều. Đun cách thủy cho sôi trong 1 phút. Làm
nguội ở nhiệt độ phòng.
Song song
tiến hành xây dựng đường chuẩn:
Cách dựng đường
chuẩn:
Hút dung dịch phenol chuẩn 1: 1000
(TT) vào các ống nghiệm với lượng như
sau: 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; 0,6 ml, 0,7 ml; 0,8 ml; 0,9 ml;
1,0 ml. Thêm vào các ống nghiệm trên mỗi ống một
lượng nước
cất vừa đủ 9,5 ml; 0,5 ml thuốc thử Folin pha loãng 2 lần; 2 ml dung dịch natri carbonat 20% (TT).
Lắc đều. Đun cách thủy cho sôi trong 1 phút. Làm
nguội ở nhiệt độ phòng.
Song song
tiến hành làm mẫu trắng (dùng nước cất thay cho mẫu vắc xin thử
nghiệm).
Đem so
màu trên máy quang phổ với bước sóng 310 nm (cả với
mẫu thử và mẫu chuẩn).
Cách tính kết quả:
a x 2 x 100
x 100
X
= ( %)
1.000.000
Trong đó:
X : Hàm lượng phenol có trong mẫu thử (%).
a x 2 : Hàm lượng phenol có trong 1 ml mẫu đã
pha loãng tìm được trên đường chuẩn.
100 : Độ pha loãng
của mẫu thử.
100/1.000.000 : Đổi ra %
Tiêu
chuẩn chấp thuận
Mỗi loại vắc xin, sinh
phẩm có tiêu chuẩn khác nhau về hàm lượng phenol (dựa vào tiêu chuẩn
của WHO hoặc tiêu chuẩn Việt
Pha dung dịch phenol chuẩn:
Cân chính xác 1g phenol (TT) hoà tan trong vừa đủ 100 ml nước cất. Trước
khi dùng pha loãng 1000 lần bằng nước cất.
Pha dung dịch natri carbonat 20%:
Cân 20g natri carbonat (TT) hoà tan
trong vừa đủ 100 ml nước
cất. Lọc vào chai đựng.
Phương
pháp 2
Mẫu thử được
trộn đều để làm thử nghiệm. Pha loãng mẫu
thử bằng nước
cất (nếu cần thiết) để có nồng độ
phenol khoảng 15 mg/ml.
Chuẩn bị mẫu phenol chuẩn
theo các nồng độ 5 mg; 10 mg; 15 mg; 20 mg và 30 mg /ml.
Lấy 5 ml các dung dịch mẫu
thử và mẫu chuẩn vào ống nghiệm, thêm 5 ml dung dịch đệm borat pH 9,0
; 5ml dung dịch aminopyrazolon và 5 ml dung dịch kali fericyanid. Lắc
đều, để yên 10 phút, đo quang phổ (Phụ lục
4.1) ở bước sóng 546 nm. Dựa vào đường
chuẩn để tính ra hàm lượng phenol có trong mẫu
thử.
Cách pha dung dịch đệm borat
pH 9,0:
Dung dịch A: Hoà tan 6,18g acid
boric (TT) trong vừa đủ 1000 ml dung dịch kali cloride 0,1M.
Dung dich B: Natri hydroxyd 0,1 M (TT).
Trộn 1000 ml dung dịch A với 420 ml
dung dịch B thu được dung dịch đệm
pH 9,0
Cách pha dung
dịch aminopyrazolon:
Dung dịch 4-aminophenazon 1% trong dung dịch đệm
borat pH 9,0.